病理组织石蜡切片染色是临床诊断的重要辅助手段[1].石蜡切片不易脱片,染色后可被长期保存,使得石蜡切片同患者病历一样,可被长期封存,对预防医疗事故的发生有一定作用,故被各大医院广泛应用.常规病理切片的制作步骤中有许多注意事项.本文主要从组织固定取材、脱水包埋、切片、漂片等过程,介绍病理石蜡切片制作过程中易出现的问题和解决办法,以期进一步改善常规病理切片的制作,提高病理切片质量.

 1、组织固定取材注意事项

临床所取标本要新鲜,否则细胞内溶酶体会破裂,造成细胞自溶.组织固定液多选用10%中性福尔马林,其有效成分为甲醛,甲醛易挥发,使得福尔马林的效用会越来越低,所以福尔马林现配现用;固定液体积要超过标本的10~20倍,否则固定不充分,影响染色;固定标本的容器要以使标本不变形为宜[2];取材时,除严格按照病理标本取材操作规范外,小标本一般全取,大标本在去除不必要的组织后,要特别注意病变部位与正常组织交界处[3];取材切片观察面要平整,否则组织经脱水后变韧,导致组织包埋时不能压平于包埋盒中,切片时修整蜡块很繁琐.

2、脱水包埋注意事项

现组织多采用程序化脱水浸蜡,所以要根据标本的多少及大小及时更换脱水机内试剂,否则会影响脱水效果,使组织与蜡不能相溶,无法制作出合格的组织蜡块.条件允许的情况下可根据组织标本的不同选择合适的石蜡,组织韧性大选择高熔点石蜡,组织软选取低熔点石蜡.包埋时,组织要充分压平于包埋模底部,以保证组织的预期观察切面在同一水平;先向包埋盒中灌滴少许液体石蜡,此步骤可使成型蜡块底部光滑平整,再将组织观察面压平于包埋盒底部,组织摆放紧凑但不重叠.为使包埋组织的蜡块快速凝固,一般先将浸液体蜡的包埋盒置于冷冻台上,蜡块在置于冷冻台上后,应在蜡大部分或完全凝固后(图1A),再移动包埋盒;若蜡块未完全凝固(图1B),而移动了包埋盒,成型蜡块底部平整度相差甚远,有的凝固蜡块底部平整(图2A),有的蜡块底部不平整(图2B),可致小标本在修片的过程中被浪费.

3、切片注意事项

切片时常见问题及常用解决方法如下:(1)切片横向褶皱过多,不能成带(图3).原因:蜡块温度过高;切片刀变钝;切片刀边缘粘有少量石蜡.解决方法:将蜡块重新放置冰袋或冷冻盒上,使蜡块降温;更换切片刀的位置,或换新的切片刀;或用水沾湿纱布,顺切片刀刀口方向,轻轻擦拭切片刀.(2)切片上有位置固定的一道或几道裂缝或裂纹(图4).原因:切片刀有小缺口;蜡块内有杂质或体积较小的似骨(钙)化性较硬的组织;包埋时蜡块不均匀凝固.解决方法:移动切片刀或更换新的切片刀;用少量盐酸软化硬的钙化性组织;重新包埋蜡块.(3)切片上有位置不定的数道小裂缝或裂纹(图5).原因:蜡块温度过高;切片刀变钝.解决方法:将蜡块重新放置冰袋或冷冻盒上,使蜡块降温;更换切片刀的位置,或更换新的切片刀.(4)切出的蜡条明显向一侧弯曲变形(图6).原因:弯曲处蜡块质地不均,蜡块未修整好,边缘毛糙[4]等;弯曲处切片刀变钝.解决方法:重新修整蜡块;移动切片刀;冷冻蜡块,蜡块质地稍变硬后也可以使弯曲变小.(5)切片厚薄不均,或是每固定几片后,切出一张完整的片子.原因:蜡块过硬或过大;蜡块夹持器或切片刀松动;切片机微动失灵,不能调节出正确的切片厚度.解决方法:组织块过硬可重新取材包埋,过大可重新包埋;调整机器,上紧刀片;修理机器.

4、漂片注意事项

漂片温度选择比蜡块熔点低10℃即可.温度过高会使蜡条产生数目不等的小气泡.

5、烤片注意事项

烤片时温度与时间的选择范围广,可从37℃烤箱烤干1天至75℃烤箱烤干20min,可以根据不同目的需要,确定烤片时间和温度,或是依石蜡熔点来确定,一般将温度控制比石蜡熔点高10~15℃.

6、染色注意事项

 (1)组织脱蜡透明等过程采用物质分子相似相溶原理,试剂有效成分容易减少,所以脱蜡试剂要及时更换[5],若脱蜡不充分,会使切片染色不均匀;因乙醇、二甲苯等易挥发,故在操作完成时,应及时封盖,溶液浓度降低会影响洗片效果;(2)染色时,盐酸乙醇分化步骤尤其重要,分化的目的是使胞核染色,而无背景色.明矾苏木精性质使其在酸性溶液中呈现红色,在碱性溶液中呈现蓝色.在盐酸乙醇分化时,切片由深蓝变为粉红色时,应停止分化.分化时,有经验者可以肉眼观察切片至粉红色时终止分化,初学者可镜下多次观察切片,至切片除胞核外,无其他背景着色时,停止分化;或是依据盐酸乙醇浓度,确定分化时间,试剂初配制时,盐酸乙醇浓度高,分化时间短,反之则分化时间延长.切片分化完成后,将切片移至弱碱性的溶液中返蓝,一般采用自来水,或是温度在50℃的自来水中,因其本身为弱碱性,且取用方便,所以被广泛使用.

7、封片注意事项

(1)需吹干或烤干切片上水分,否则镜下观察时有一层白雾,导致细胞轮廓不清楚;(2)病理组织切片HE染色一般采用中性树胶封片,封片时以无气泡为准,否则会影响镜下观察;常用24mm×32mm大小的盖玻片,只需用一次性的巴氏吸管滴2滴中性树胶即可,过少则致封片不完全,过多则致中性树胶外溢.