生物玻片标本的主要制作方法

要在显微镜下观察和研究物体的内部构造，一般在自然状态下是无法进行的。因为整个动植物体大部分都是不透明的，不能直接在显微镜下观察，一定要经过特殊的手段，把要观察的材料制成玻片标本，使光线能透过去才能作显微镜观察。制作生物玻片标本的方法很多，一般可以归纳为两类，一类是非切片法，另一类是切片法。

一、非切片法

非切片法是指不用切片机、不须经过切片手续，而是用物理或化学的方法将生物体组织制成薄片或分离成单个细胞，或将整个生物体进行封藏而制成玻片标本的方法。这类方法的优点是制片过程简单、速度快，而且组织的各个组成部分不被切断，仍能保持每个单位的完整性。根据材料性质和研究目的以及操作方法的不同，非切片法可以分为整体装片法、涂片法、压片法、分离装片法、伸展法和磨片法等。用这些方法可以把材料制成临时玻片标本，也可以制成玻片标本。在制片过程中，一般要经过固定→冲洗（遇必要时）→染色→脱水→透明→封藏等步骤。

1.整体装片法

整体装片法是将整个微小的生物体或某部分器官封藏起来制成玻片标本的一种方法。适用这种方法的一般是身体很小或自身为一薄片的生物体或器官，例如单细胞藻类、丝状藻类、菌类、柔嫩的苔藓植物、蕨类植物的原叶体与孢子囊、高等植物的表皮、小花和花粉粒等、原生动物、水螅以及昆虫的翅、触角、足、鸟的羽毛、鱼的鳞片或者鸡的幼胚等都可以用此法制片。

2.涂片法

涂片法是将动植物的一些呈液体或半流动性材料以及比较疏松的组织细胞均匀地涂布在载玻片上的一种非切片制片方法。这种方法很简便，对单细胞生物、小形群体藻类、细菌、血液、尿液、粪便以及高等动植物较疏松的构造如精巢和花药等很适用。

涂布的方法和顺序因材料的性质不同而有区别。

固体材料如花药、精巢等，可将材料放在清洁的载玻片上，用清洁的保安刀片压在材料上面向一边抹去，将其中的细胞压出来，使之成为一均匀薄层，然后迅速以水平方向放入固定液中固定。

液体材料如血液、尿液、浮游藻类等，可先用滴管吸取一滴材料滴在用左手持平的载玻片的右端近1/4处，然后用右手持另一载玻片，将短边置于液滴的前（左）方并使其与液滴接触，液体便沿底边向两侧漫过去。此后以两玻片呈30°～45°的角度用右手把所持玻片平稳地向前（左）推动，即可推出均匀的涂片。涂好的片子要在空气中迅速晾干再固定。

有的盖玻片从未用过，上面就有许多斑点，影响观察，这样的盖玻片可用稀硫酸处理，能使盖玻片清澈透明，效果较好。盖玻片用稀硫酸处理的方法是先在小烧杯里倒入一点稀硫酸（浓度不限，浓的可缩短处理时间，稀的则延长处理时间），再在硫酸内投入盖玻片，轻轻振荡搅拌，数分钟后倾去稀硫酸，用清水冲洗干净即可。

上述的各种涂片在固定完毕之后，可先在显微镜下检查，如合适时可按各自的制片目的进行染色、脱水、透明及封藏，或不封藏。

3.压片法

压片法是将植物或动物的一些比较巯松而柔软的材料，如花药、根尖、水螅、蠕虫的精巢、果蝇（或其他双翅目昆虫）的幼虫唾液腺等，用较小的压力压碎在载玻片上使其成一薄层的一种非切片法。它是细胞学上常用的方法之一。

压片时，有的可用针尖、刀尖直接压在材料上压碎，有的则先把盖玻片盖在材料上，然后再用刀柄、指甲或用未削开的平头铅笔杆轻压盖玻片，将材料压碎。为了使材料不粘在一起而容易分开，事先须在载玻片上加上一些液体如水、林格氏液（Ringer’s solution）、醋酸羊红染色剂等。

4.分离装片法

为了观察和研究在组织或器官里的单个细胞或纤维的形状，必须使细胞之间的间质消除，使细胞分离开来，这样制成玻片标本的方法称为分离装片法。它一般包括解离法和梳离法。

解离法是借助药物的作用，将组织浸软，使组织的各个组成部分之间的某些结合物质被溶化而分离的一种非切片法。此法一般适用于木质化组织，如木材、草本植物茎等。

梳离法是将一些纤维组织，如肌肉、神经等在解离的基础上再采用梳离毛发的方法，使纤维沿着纵轴的方向分离，这种制片法称为梳离法。

5.磨片法

一些含有矿物质的比较坚硬的动物组织要作成玻片标本时，常把材料直接放在砂石上磨成薄片，此法即为磨片法。珊瑚的骨骼、软体动物的贝壳、脊椎动物的硬骨、角以及牙等都可用本法制成玻片标本。在用硬骨作磨片标本时，一般经过清除肌肉、脱脂、锯材、磨薄、水洗、脱脂、干燥、封藏等步骤。

6.伸展装片法

伸展装片法是将材料在载玻片上展平制成装片的一种方法。例如肠系膜、膀胱或疏松结缔组织制片均用此法。它的一般过程为：展片、固定、水洗、染色、脱水、封藏等。

二、切片法

切片法即用刀片将材料切成薄片的方法。最简单、最古老的是徒手切片法，其后逐渐改进，出现了许多精密的切片方法，这些都是应用特制的切片机进行切片。在用切片机切片之前，必须设法使组织内渗入某些支持物质，使组织保持一定的硬度，然后才能切。根据支持剂的不同可分为石蜡切片法、火棉胶切片法和冰冻切片法等。

1.徒手切片法

徒手切片法即不需要什么特殊工具，而是将欲观察的新鲜材料直接持在手里或者将其夹在夹持物中用刀片切成薄片的方法。适于这种方法的一般仅限植物材料。此法虽然比较古老，并有一定的局限性，但由于方法简单，容易掌握，省时方便，因此至今在生物学教学中仍然是观察形态构造的一种基本切片方法。它的一般过程步骤如下。

（1）材料持法 应用左手持材料或夹持物（夹有材料的夹持物，如萝卜、莴苣、马铃薯等），夹持在拇指和食指（或其他指）之间。拇指应略低于食指，以免切时伤手。材料要略高于拇指和食指才便于切。

（2）持刀法与切片 右手持刀（保安刀或双面刀片），刀身放平，切片的方向应向着切片者。切片时先将材料和刀口蘸上些水，切去材料上端不整齐的一段，然后再正式切。切时要保持在同一水平面上，从左前外方向右内方迅速拉切，不可来回拉锯式切，动作要迅速敏捷。

（3）取片 切下的片子不要轻易丢弃，目视合乎需要的要立即浸入水中，让其自由落下或用洁净的湿毛笔从刀片上轻轻地抹入培养皿清水中，要多切几片放入。

（4）选片和装片 将切好的薄片用清洁的毛笔从水中轻轻挑起放于载玻片上，在显微镜下检查，选出合适的切片保留在载玻片上，使其保持一定量的水，加上盖玻片，作成临时装片。若需要较长时间保存，则用甘油代替水将材料封藏起来。若需要长时间保存，则可按照制片的一般方法，经固定→冲洗→染色→脱水→透明→封藏，制成玻片标本。

2.石蜡切片法

石蜡切片法是一种常用的切片法。它所使用的支持剂是石蜡，即使组织内部透入石蜡并将组织块包埋进石蜡之中。这种切片法的主要优点是切下的片子薄而匀，还能作连续切片。

一般材料都适宜使用这种切片方法，但制作手续比较复杂。一般包括下列步骤：取材→固定→冲洗（从各种固定液取出后）→脱水（在逐渐加浓的酒精中）→透明→浸蜡透入（使石蜡透入组织的每个细胞）→包埋（用纯石蜡包埋成块）→切片→贴片（黏附切片于载玻片上）→脱蜡→复水（经各级乙醇下降至50％乙醇）→染色→脱水→透明→封藏。

上述步骤中有几个重要环节，需简述其作用和作法。

（1）固定的目的 其目的在于保存组织中各细胞的形态结构和生活时相似。欲达此目的，必须对固定液的选择、固定材料的性质、大小和固定的时间以及研究的目的等加以注意，不可轻率从事。

（2）冲洗 经过一定时间的固定后就须冲洗。除乙醇外，组织中的固定液必须彻底洗净。冲洗的手续应依固定液的性质而定。例如水溶液常用清水和低浓度乙醇溶液来洗，乙醇溶液则用同等强度的乙醇冲洗。冲洗的时间为12～24h，每隔1～2h换1次，如用水洗，用流水。

（3）脱水 要作玻片标本，必须从组织中除去水分，这个手续叫做脱水。特别是材料须包埋在石蜡中，脱水则更为必要，因为石蜡不能与水混合。乙醇是最常用的脱水剂，它和水的亲和力很强。脱水须缓慢进行以保证材料不被过度收缩。因此，可以把乙醇配成不同梯度的浓度分阶进行。

（4）染色 除了很少一部分固定剂可使组织产生视觉上的差异外，大部分材料必须经过染色才能使其各部分显现出不同的颜色，产生不同的折射率以显示它不同的构造。

（5）浸蜡 将已透明的材料投入已熔化的石蜡中，即取代透明剂，使组织中的一切空隙为石蜡透入而填满，为了使石蜡更好地浸入到组织中去，就必须注意恒温箱的温度，其温度应适宜。太高，会使材料收缩；太低，石蜡会冻结而无法透入到组织中去。适宜的温度是蜡杯中蜡的上半部保持溶解状态，而下半部特别是底部的蜡应该处于冻结的状态。

（6）切片 用石蜡包埋块包埋的蜡块，一般使用旋转式切片机进行切片。在切片之前需将蜡块切小，切至材料四周仅留1～2mm的石蜡即可，切修时还应将蜡块四周及要切的那一面切平，特别是被切的上下两面需平行，否则会发生弯曲。蜡块修切后须用熔化的蜡粘在木块或金属块上，再沿四周用烧烫的解剖针烫几下，使蜡块粘得更牢固。切片时将木块或金属块装在切片机上，切片刀装在刀架上，使蜡块面与刀口成平行方向，调整刀口与蜡块的角度，一般以10°内为宜。角度太大或太小均切不出切片，切片前，将蜡块置于冰箱中冷藏一会，切片时再经常用冰块将蜡块冰冻，这样可增加石蜡的硬度，同时也可减少切片的皱折，使切片能较顺利地切出。

7）透明 在制作切片标本的过程中，透明在两种情况下进行。一，透明是在组织脱水后浸蜡前进行的。其目的不在于为了显微镜观察，而是作为从脱水剂进入包埋剂的桥梁。因此，透明剂必须既能与乙醇混合，又能与石蜡融合无间，二甲苯即具此性质，故被选为常用的透明剂。二，透明是在片子脱水与封藏之间进行的。其目的除了作为从脱水剂进入封藏剂的桥梁外，尚有使标本透明以便于观察的作用。

（8）封藏 制作玻片标本的最后一步为封藏。常用的封藏剂有树胶和甘油等。封藏的目的在于使切片能保存，便于镜检。

3.火棉胶切片法

火棉胶切片法所使用的支持剂是火棉胶。这种方法的优点是包埋过程不经高温，可以避免组织收缩及变脆，适用于精细材料（如脑）的切片，也因火棉胶有韧性，切片不致有折卷或破裂，适于大块组织及多空洞的组织（如脑、眼球）的切片。缺点是手续麻烦，费时较久，切片不能切薄（10μm以上），不能作连续切片。

4.冰冻切片法

冰冻切片法是将已固定或新鲜的组织块不经脱水和包埋先进行冰冻，然后在切片机上切片的一种方法。这种方法的优点是：①制片速度快，因此常用于临床上的病理手术诊断；②能保存组织内某些易被有机溶剂所溶解的物质，例如脂肪和酶等，同时还可以防止组织块的收缩，保持原形。缺点是所切片子较厚，又不能作连续切片，还有易碎的毛病。